說(shuō)起反轉(zhuǎn)錄，小編相信當(dāng)大家提取出高質(zhì)量的RNA時(shí)，肯定開心的手舞足蹈，滿心歡喜想著接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)輕輕松松搞定！這樣想沒(méi)錯(cuò)，但是如果你想在論文或者匯報(bào)中得到漂亮的數(shù)據(jù)，那反轉(zhuǎn)錄這一步也非常關(guān)鍵。所以今天小編給大家梳理了反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意的幾個(gè)要點(diǎn)，希望大家在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中多多留意，獲得漂亮的數(shù)據(jù)。
一、選擇最佳的反轉(zhuǎn)錄引物
反轉(zhuǎn)錄引物一般分為三類：oligo dT、隨機(jī)引物、基因特異性引物。oligo dT，可識(shí)別具有poly(A)尾的真核mRNA，從而獲得真核生物mRNA全長(zhǎng)。隨機(jī)引物，可以結(jié)合到樣本中的任何類型RNA，但并不能獲得整個(gè)基因全長(zhǎng)的cDNA。基因特異性引物，是根據(jù)實(shí)驗(yàn)者的特定需求設(shè)計(jì)出來(lái)的，適用于目的序列已知的情況，產(chǎn)生所需的cDNA。
二、考慮RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)
若要獲取全長(zhǎng)RNA的反轉(zhuǎn)錄，那么我們就需要考慮RNA內(nèi)部是否含有二級(jí)結(jié)構(gòu)，因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄酶在遇到二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)會(huì)終止反應(yīng)或從模板上脫落下來(lái)。通常GC含量高的基因意味著RNA很難被變性且不可能是單鏈。高效且熱穩(wěn)定性強(qiáng)的反轉(zhuǎn)錄酶，可有效克服高GC、低豐度模板的反轉(zhuǎn)錄難題。
三、去除基因組DNA
污染性基因組DNA(gDNA)可能會(huì)干擾RNA反轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致后續(xù)PCR或qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性、高背景或檢測(cè)率低等情況。通常在RNA提取過(guò)程中加入合適濃度的DNase I，37℃加熱10-15min，去除干擾基因組DNA。另外，如果是做qPCR實(shí)驗(yàn)，更簡(jiǎn)單的方法則是選用含有去除基因組DNA的試劑盒。
四、選擇合適的反轉(zhuǎn)錄方法
RT-PCR和RT-qPCR有兩種選擇：一步法和兩步法。一步法，反轉(zhuǎn)錄和（q）PCR擴(kuò)增是在同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行。兩步法，反轉(zhuǎn)錄與（q）PCR擴(kuò)增反應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。
注意事項(xiàng)這么多，您需要一套可全面應(yīng)對(duì)上述問(wèn)題的高性能產(chǎn)品！
GenStar新一代StarScript III M-MLv反轉(zhuǎn)錄酶，擁有卓越的cDNA合成能力，全面提升合成產(chǎn)量、提高熱穩(wěn)定性，克服了低豐度、復(fù)雜模板難題！
產(chǎn)品特點(diǎn)
·熱穩(wěn)定性
可耐受37-65℃反應(yīng)溫度，適合高GC復(fù)雜模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
·兼容性強(qiáng)
適用于不同物種、各種類型的RNA模板。
·靈敏度高
針對(duì)各種RNA模板，克服低豐度、復(fù)雜模板難題。
·產(chǎn)品全面
根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用場(chǎng)景，可選擇含去基因組試劑、預(yù)混試劑或試劑盒。
·應(yīng)用廣泛
可應(yīng)用于基因全長(zhǎng)cDNA合成、qPCR等實(shí)驗(yàn)。
產(chǎn)品性能展示
1. StarScript III耐受37-65℃反應(yīng)溫度
不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度獲得的水稻cDNA，1 kb片段擴(kuò)增
StarScript II最佳反應(yīng)溫度為42℃，耐受50℃；StarScript III最佳反應(yīng)溫度50-55℃，耐受65℃。
2. 低豐度、復(fù)雜模板也能完美反轉(zhuǎn)錄
以水稻RNA為模板，不同品牌反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，qPCR檢測(cè)結(jié)果
GenStar StarScript III靈敏度高，對(duì)于高GC、低表達(dá)基因的檢測(cè)效果理想。
3. 線性范圍廣，反轉(zhuǎn)錄效果佳
GenStar StarScript III一步法qRT-PCR試劑盒-探針?lè)ǎ║NG）（Cat#A338）檢測(cè)小鼠RNA模板，檢測(cè)基因GAPDH
結(jié)果顯示，A338靈敏度高，檢測(cè)下限可達(dá)1 pg；熒光信號(hào)采集能力強(qiáng)，兼顧高擴(kuò)增效率；具防污染體系，有效避免氣溶膠污染。
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·反轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)無(wú)需調(diào)整，操作簡(jiǎn)便。
·去基因組反轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑：去gDNA，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
·一管化去基因組反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液：一管化、含去gDNA，qPCR模板制備的最佳選擇。
一步法RT-PCR
一步法RT-PCR專用預(yù)混液，反轉(zhuǎn)錄和PCR在同一管內(nèi)進(jìn)行，操作便攜。
一步法qRT-PCR
高特異，高靈敏，速度快，可選防污染體系，適用于RNA病毒檢測(cè)的qRT-PCR預(yù)混液。
