師妹每次提RNA都要整理儀容儀表

實(shí)驗(yàn)臺(tái)也是上上下下打掃的非常亮堂

最后再雙手合十，嘴里不知道念叨著什么

這才能開(kāi)始提取RNA！

當(dāng)然，如果能得到理想RNA，

那我相信各位小主也要拜她為師了！

畢竟對(duì)很多同學(xué)來(lái)說(shuō)

提取RNA簡(jiǎn)直就是噩夢(mèng)般的存在

我們來(lái)嘮一嘮

如何提取高品質(zhì)的RNA

UV光譜分析

• A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，如DNA、RNA、引物等。

• A280nm是蛋白質(zhì)、酚類(lèi)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)。

• A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，如多肽、苯酚等。

• A260/A280的比值在1.8-2.2，說(shuō)明RNA純度較好。

  若比值<1.8，說(shuō)明提取的RNA中存在蛋白質(zhì)、酚類(lèi)等污染；

  若比值>2.2，說(shuō)明提取的RNA已被DNA污染或者RNA已降解。

• A260/A230的比值在1.8-2.0，說(shuō)明RNA純度較好。

  若比值小，說(shuō)明提取的RNA中可能存在糖類(lèi)、鹽或有機(jī)溶劑。

瓊脂糖凝膠電泳

• 若28S和18S條帶清晰、明亮、銳利，且28S條帶亮度約為18S的1.5-2.5倍，則說(shuō)明RNA質(zhì)量較好。

• 若RNA條帶不亮或缺失，可能與上樣量不足、RNA在凝膠中發(fā)生擴(kuò)散或降解等因素有關(guān)。

• 若條帶彌散，可能原因有RNA已降解、電泳時(shí)電壓或電流過(guò)大、上樣量過(guò)高或過(guò)低等。

• 若條帶大小超過(guò)28S，說(shuō)明可能存在基因組DNA污染，建議使用DNaseⅠ處理。

采集組織及細(xì)胞之后，應(yīng)立即滅活內(nèi)源性RNase，以防RNA降解。小編與大家分享了3種方法。

1. 樣品加入裂解液（如胍鹽）后，立即徹底勻漿。
   注：加入裂解液之前必須確保樣品處于冷凍狀態(tài)。

2. 使用液氮快速冷凍樣品后再置于-80℃保存。必須保證組織塊足夠小，才能使其浸入液氮的瞬間就能凍結(jié)，以確保RNase瞬間失活。

   注：待提取樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融。為了確保RNA的提取質(zhì)量，請(qǐng)盡量使用新鮮樣品。

3. 將樣品充分浸泡在RNA穩(wěn)定劑中。它是一種無(wú)毒、水相收集試劑，可穩(wěn)定并保護(hù)完整、未冷凍的組織和細(xì)胞樣品中的RNA。
   注：組織樣品切片一定要?。?0.5 cm），以便在RNase破壞RNA之前穩(wěn)定劑迅速滲透組織。

   
   

• 所有物體表面（如實(shí)驗(yàn)儀器、工作臺(tái)面）可用去RNase污染的溶液擦拭。

• 建議設(shè)立RNA抽提專(zhuān)區(qū)，實(shí)驗(yàn)用的器具亦可專(zhuān)用。

• 使用的玻璃器皿可進(jìn)行150℃干熱滅菌4小時(shí)的處理。

• 塑料器皿可用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在室溫或37℃處理12小時(shí)，然后再高溫高壓滅菌以除去殘留的DEPC，或者在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水徹底清洗再滅菌烘干，即可去除RNase。

• 采用無(wú)菌操作規(guī)程，注意經(jīng)常更換新手套，以避免RNase污染。

  
  

(1)溶液法

又稱(chēng)異硫氰酸胍/苯酚法、TRIzol法。異硫氰酸胍不僅僅是一種強(qiáng)蛋白變性劑，而且也是很強(qiáng)的RNase抑制劑。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中蛋白質(zhì)、核酸物質(zhì)解聚，從而釋放核酸。這種方法簡(jiǎn)便快捷，適用于動(dòng)植物細(xì)胞、組織、酵母細(xì)胞、細(xì)菌等多種樣品的總RNA提取。

(2)離心柱法

離心柱的材料通常是玻璃纖維、硅衍生物或者離子交換膜，可以在特定適宜的條件下特異、可逆地結(jié)合RNA。操作過(guò)程更加方便快捷，且提取的RNA純度較高，可是存在著有物種特異性、價(jià)位較高等不足。

(1)徹底勻漿樣品

細(xì)胞或組織的充分勻漿能夠減少RNA的損失和降解。大部分培養(yǎng)細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液后，使用吸管或加樣器吹打等較溫和的方式勻漿。而組織樣本、酵母以及細(xì)菌通常使用更加劇烈的方式，例如細(xì)菌就需要用酶消化其細(xì)胞壁，從而保證細(xì)胞充分裂解和RNA的提取得率。

(2)RNA的正確沉淀

一般情況下，可使用異丙醇來(lái)沉淀RNA。也有使用共沉淀劑（如Glycogen、Linear Acrylamide）來(lái)輔助進(jìn)行RNA沉淀的特殊情況，以滿(mǎn)足一些下游應(yīng)用的需要。注意沉淀后應(yīng)避免過(guò)于干燥，以防RNA沉淀難以重新溶解。

(3)RNA的重懸

許多RNA提取步驟的最后一步操作就是溶解純化的RNA沉淀，通常使用DEPC處理水進(jìn)行重懸溶解即可，也有使用特殊的重懸溶液的情況。理想的重懸溶液應(yīng)該滿(mǎn)足三點(diǎn)要求：無(wú)RNase污染、較低的pH值（pH 6-7）、含有螯合劑，以保護(hù)RNA不被帶入的RNase降解。為了幫助溶解，RNA沉淀置于重懸溶液后可在50 ~ 60℃溫度下孵育5 min，并不時(shí)輕搖以加速溶解。

(4)RNA的保存

重懸的RNA若需短期保存，可置于-20℃?；蛘邔⑵溥m量分裝后置于-65 ~ -80℃長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。值得注意的是RNA的半衰期比較短、易降解，建議抽提后盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

重點(diǎn)來(lái)啦！總RNA提取需要一款優(yōu)秀的試劑

• 通用性強(qiáng)：適用于動(dòng)植物細(xì)胞、組織、酵母細(xì)胞、細(xì)菌等多種樣品的總RNA提取。

• 一劑多用：同一樣本可提取總RNA、DNA和蛋白質(zhì)。

• 提取率高：每1×10⁶培養(yǎng)細(xì)胞可提取約10 μg總RNA。

• 性?xún)r(jià)比高：貼心的價(jià)格，高品質(zhì)的結(jié)果。

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